Identyfikacja gatunkowa zwierząt w oparciu o próbki pochodzące ze skóry i włosów z wykorzystaniem technik molekularnych

PARLAMENT EUROPEJSKI I RADA UNII EUROPEJSKIEJ 11 grudnia 2007r. wydały rozporządzenie zakazujące wprowadzania do obrotu oraz przywozu do Wspólnoty lub wywozu ze Wspólnoty skór z kotów i psów oraz produktów zawierających takie skóry. W wielu przypadkach identyfikacja gatunkowa zwierząt na podstawie skór surowych, bądź przetworzonych jest wyjątkowo trudna. Dotyczy to zarówno gatunków blisko spokrewnionych jak i odległych od siebie, ale charakteryzujących się podobnymi cechami okrywy włosowej. Taka identyfikacja nie zawsze jest wiarygodna, ze względu na zabiegi jakiem poddawana jest skóra. Dotyczy to szczególnie skór przetworzonych (wyprawa farbowanie strzyżenie itp.). Możliwość wystąpienia pomyłek przy morfologicznej identyfikacji skór można stwierdzić u wielu gatunków blisko ze sobą spokrewnionych. W takich przypadkach wykorzystuje się metody biologii molekularnej, które są wiarygodne i jednocześnie uznawane w świecie. Wykorzystanie markerów mikrosatelitarnych w połączeniu z nowoczesnymi, zautomatyzowanymi metodami ich analizy, umożliwia zastosowanie precyzyjnej kontroli pochodzenia zwierząt.  Sekwencje STR, dzięki wysokiemu poziomowi zmienności i prostemu schematowi dziedziczenia są bardzo dobrym markerem genetycznym, wykorzystywanym w badaniach ekologicznych, w molekularnych metodach identyfikacji płci i przynależności gatunkowej osobnika. W tym przypadku wykorzystuje się allele specyficzne dla danego gatunku, a nawet rasy. Liczba par zasad w analizowanych loci jest charakterystyczna dla poszczególnych gatunków. Przeprowadzając analizę długości mikrosatelit dla konkretnego locus można wykluczyć (lub potwierdzić), że badana próbka DNA pochodzi od psa czy też od przedstawiciela gatunku  utrzymywanego w warunkach hodowli fermowej.  

 

W związku z pojawieniem się dowodów obecności we Wspólnocie nieetykietowanych futer z kotów i psów oraz produktów zawierających takie futra, jak również powszechną obawą konsumentów przed zakupem takich produktów, w dniu 18 grudnia 2003 r. Parlament Europejski przyjął deklarację, w której zażądał wstrzymania handlu futrami z kotów i psów i produktami zawierającymi ich fragmenty. To działanie miało w zamyśle przywrócić zaufanie europejskich konsumentów do wyrobów futrzarskich jak i całej branży. W konkluzjach Prezydencji, przedstawionych w trakcie posiedzenia Rady ds. Rolnictwa i Rybołówstwa w dniu 19 czerwca 2006 r., dotyczących Wspólnotowego planu działań na rzecz ochrony i dobrostanu zwierząt na lata 2006-2010, stwierdzono potrzebę przyjęcia możliwie jak najszybciej zasad dotyczących handlu futrem z kotów i psów. Niektóre państwa członkowskie UE przyjęły ustawodawstwo mające na celu uniemożliwienie produkcji i sprzedaży futer z tych gatunków. Jednocześnie, oprócz zakazu alternatywnie niektóre państwa wprowadziły szczególne wymogi etykietowania takich wyrobów. W związku z istniejącymi różnicami dotyczącymi regulacji handlu, przywozu, produkcji i etykietowania futer i produktów futrzarskich w obrębie poszczególnych państw członkowskich UE – stwierdzono, że podmioty zajmujące się obrotem tymi produktami mogą mieć problemy ze stosowaniem tych przepisów. Związane jest to głównie z tym, że takie produkty nie mogą być przedmiotem legalnego handlu w jednym lub kilku państwach członkowskich UE lub, że handel w jednym lub kilku państwach członkowskich podlega dodatkowym wymogom, mającym na celu niedopuszczenie do używania futra z kotów i psów. Takie różnice stanowią przeszkodę dla swobodnego przepływu towarów na jednolitym rynku. W treści Projektu oprócz zakazu wprowadzania do obrotu we Wspólnocie jak również przywozu i wywozu futra z kotów i psów oraz produktów zawierających takie futro, wprowadza także stały obowiązek państw członkowskich informowania Komisji Europejskiej o metodach analitycznych stosowanych w celu identyfikacji gatunku pochodzenia futra. Ponadto, państwa członkowskie UE zostają zobowiązane do ustanowienia odpowiedniego systemu kar wobec podmiotów łamiących postanowienia tego rozporządzenia. Poprzedni skład europarlamentu niemal jednogłośnie poparł sprawozdanie niemieckiej deputowanej z grupy Europejskiej Partii Ludowej/Europejskich Demokratów, Elizabeth Jeggle. W dokumencie zwrócono uwagę na konieczność zaostrzenia przepisów dotyczących ochrony zwierząt i poprawy ich dobrostanu. Mając to na względzie 11 grudnia 2007r. PARLAMENT EUROPEJSKI I RADA UNII EUROPEJSKIEJ wydały rozporządzenie zakazujące  wprowadzania do obrotu oraz przywozu do Wspólnoty lub wywozu ze Wspólnoty skór z kotów i psów oraz produktów zawierających takie skóry. Nie należy jednak sądzić, że działania te oprócz na pewno istotnych dla nas Europejczyków aspektów moralnych nie mają również i innego charakteru, a mianowicie walki z hodowlą zwierząt futerkowych. Należy zwrócić uwagę, że dla „skrajnie zielonych” dobra wiadomość dla psów i kotów jest zarazem przykładem hipokryzji, gdyż zakazując importu futer z psów i kotów Europejczycy są jednocześnie olbrzymim producentem futer z innych zwierząt. Przykład ten pokazuje, że należy poprzeć wszelkie działanie zmierzające do certyfikacji ferm a co za tym idzie finalnego produktu jakim jest skóra, aby móc mieć w ten sposób argumenty do walki o utrzymanie hodowli. W wielu przypadkach identyfikacja gatunkowa zwierząt na podstawie skór surowych, bądź przetworzonych jest wyjątkowo trudna. Dotyczy to zarówno gatunków blisko spokrewnionych jak i odległych od siebie, ale charakteryzujących się podobnymi cechami okrywy włosowej. Taka identyfikacja nie zawsze jest wiarygodna, ze względu na zabiegi jakiem poddawana jest skóra. Dotyczy to szczególnie skór przetworzonych (wyprawa farbowanie strzyżenie itp.). Możliwość wystąpienia pomyłek przy morfologicznej identyfikacji skór można stwierdzić u wielu gatunków blisko ze sobą spokrewnionych jak np. norki Mustela vision, tchórza Mustela putorius, norki europejskiej Mustela lutreola, kuny domowej Martes foina czy kuny leśnej Martes marten itp. W takich przypadkach wykorzystuje się metody biologii molekularnej, które są wiarygodne i jednocześnie uznawane w świecie. Problemy te dotyczą zarówno gatunków hodowanych jak i dziko żyjących. W  przypadku  kuny leśnej (Martes martes) i kuny domowej (Martes foina), które są morfologicznie bardzo podobne jak również wykazują wiele zbieżności w trybie życia i składzie pożywienia to rozpoznanie jest bardzo trudne. Różnią się preferencjami środowiskowymi; kuny leśne zasiedlają przeważnie większe kompleksy leśne, podczas gdy kamionki żyją najczęściej w pobliżu siedzib ludzkich. Porównawcze badania prowadzi się rzadko, a ich wyniki nie były jednoznaczne, głównie ze względu na trudności związane z gatunkową identyfikacją odchodów. Dopiero analiza DNA wyizolowanego z odchodów umożliwia rozpoznanie zarówno gatunku, jak i poszczególnych osobników. Wykorzystano tutaj marker mikrosatelitarny Mel10, który u kuny leśnej ma długość od 154 do 166 par zasad, natomiast u kuny domowej – 128 par zasad. Rozwój metod genetyki molekularnej umożliwił łatwy dostęp do informacji na temat kodu genetycznego organizmów. Złożyły się na to opracowanie metod izolacji DNA z różnorodnych materiałów (między innymi z większości tkanek roślinnych, zwierzęcych tkanek miękkich, krwi, kości, śliny, włosów, moczu, odchodów, materiałów muzealnych, a nawet skamielin) Kolejnym krokiem milowym było opracowanie metody PCR mającej na celu amplifikację fragmentu DNA w ilościach umożliwiających dalsze analizy molekularne. Wysoka czułość reakcji umożliwia detekcję określonych sekwencji nawet w śladowych ilościach materiału o stosunkowo niskiej jakości DNA. Dzięki temu pozwala wykorzystywać próbki zbierane w sposób nie inwazyjny oraz z materiału poddanego obróbce np. skóry zwierząt. 

 

Metody genetyki molekularnej znalazły zastosowanie w różnych dziedzinach wiedzy, 
takich jak:      

 

medycyna sądowa, wykorzystująca analizy molekularne do ustalania tożsamości przestępców oraz ich ofiar na podstawie analizy DNA ze śladów krwi, śliny czy włosów oraz do ustalania ojcostwa;  

 

archeologia, historia i antropologia, posługujące się metodami molekularnymi do odtwarzania tras migracji ludności oraz do określania pokrewieństwa poszczególnych grup etnicznych;     

 

paleontologia, gdzie zastosowanie znajduje metoda zegara molekularnego, oparta na założeniu, że liczba różnic w sekwencji nukleotydowej homologicznych genów jest wprost proporcjonalna do czasu, jaki upłynął od rozdzielenia się badanych gatunków;     

 

filogenetyka, wykorzystująca metody molekularne do konstruowania drzew pokrewieństwa rodowego opartych na różnicach w sekwencji DNA między badanymi taksonami;     

 

biogeografia, której poddziedzina, zwana filogeografią, zajmuje się badaniem zależności między przestrzennym rozmieszczeniem organizmów a ich podobieństwem genetycznym w skali gatunku i międzygatunkowej.     

 

hodowla zwierząt w tym zwierząt futerkowych  Analizy molekularne, które umożliwiłyby identyfikacje skór powinny być oparte o polimorfizm DNA. Do przeprowadzenia analiz genetycznych potrzebne jest DNA, którego źródłem są różnego rodzaju komórki zawierające jądra. Tak więc, mogą to być jądrzaste komórki nabłonkowe, komórki naskórka, czy też komórki cebulki. Blisko spokrewnione gatunki można identyfikować na podstawie zestawów markerów mikrosatelitarnych. Stosuje się je w przypadku, kiedy nie można znaleźć pojedynczych markerów umożliwiających identyfikację np. wilka i psa. Cześć metod stosowanych do identyfikacji badanych taksonów może być również wykorzystana do wykrywania osobników pochodzących z kojarzeń pomiędzy gatunkami, np. mieszańce wilka z psem rozpoznaje się w oparciu o frekwencje alleli kilkunastu markerów mikrosatelitarnych. Najczęściej 99.9% wiarygodność badanej próby DNA uzyskuje się stosując od kilku do kilkunastu markerów, np. prawdopodobieństwo wykluczenia rodzicielstwa u psów przeprowadza się w oparciu o panel 12 sekwencji mikrosatelitarnych. Przykładem możliwości wykorzystania badań genetycznych w różnicowaniu skór zwierząt mogą być analizy przeprowadzone w 1995 roku, przez naukowców niemieckich, którzy zbadali DNA wyizolowane ze skóry, teoretycznie pochodzącej z wilka (skóra znajdowała się od wielu lat w muzeum). Ustalenie pochodzenia gatunkowego tej skóry było przedmiotem wielu wcześniejszych analiz mikroskopowych, w których analizowano budowę włosów. Dopiero badanie DNA pozwoliło na jednoznaczne określenie pochodzenia skóry, która niestety okazała się skórą psa. Zastosowanie komercyjnego zestawu StockMarks® for Dogs Canine Genotyping Kit firmy Applied Biosystems do identyfikacji osobniczej zwierząt gospodarskich z rodziny Canidae, oraz ewentualnego wykorzystania go do kontroli pochodzenia zajmowali się między innymi Jakubczak i Jeżewska [2008]. Badaniami objęli łącznie 90 zwierząt należących do trzech gatunków: lisa pospolitego (Vulpes vulpes), lisa polarnego (Alopex lagopus), oraz jenota (Nyctereutes procyonoides). Wykazali, że analizowane sekwencje mikrosatelitarne w populacji lisa pospolitego, polarnego i jenota cechuje wysoki stopień polimorfizmu oraz przydatność większości analizowanych locus do kontroli pochodzenia i identyfikacji osobników na fermach lisów i jenotów. 

 

 

Tab. 1. Wybrane sekwencje mikrosatelitarne oraz ich długości dla poszczególnych gatunków zwierząt futerkowych. 

 

locus             wielkość allelu

                             lis pospolity             lis polarny             jenot             pies 

FHC2079             247-255             250-278             361-385    263-299 

PEZ1             139                     170-182                     141-153             92-136  

 

Identyfikacja gatunkowa skóry polega więc na analizie charakterystycznych dla danego gatunku miejsc fragmentu DNA. Badania genetyczne, opierające się o wyżej opisane metody są szeroko stosowane w badaniach ekologicznych, gdzie jednym z podstawowych dążeń jest dokładne rozpoznanie gatunków i poszczególnych osobników. Metody te są wykorzystywane między innymi do identyfikacji wilka, kojota, wydry, tchórza, pumy, rysia, jaguara, lwa, czy ocelota. Znaczna większość, bo aż 95% DNA, są to sekwencje, które nie pełnią funkcji kodującej. Do tej pory jest niejasna funkcja jaką pełnią te sekwencje, jednak dzięki swym cechom, przede wszystkim ogromnej wielopostaciowości (tzw. polimorfizm), znalazły one zastosowanie w genetyce molekularnej. Poszczególne formy sekwencji niekodujących (mikrosatelity) charakteryzują się zmienną liczbą tandemowo ułożonych powtórzeń np. CA, lub GAAT. Wydaje się, że markery mikrosatelitarne mogłyby być najlepszym wskaźnikiem pozwalającym na jednoznaczną identyfikację skór. Wykorzystanie markerów mikrosatelitarnych w połączeniu z nowoczesnymi, zautomatyzowanymi metodami ich analizy, umożliwia zastosowanie precyzyjnej kontroli pochodzenia zwierząt.  Sekwencje STR, dzięki wysokiemu poziomowi zmienności i prostemu schematowi dziedziczenia są bardzo dobrym markerem genetycznym, wykorzystywanym w badaniach ekologicznych, w molekularnych metodach identyfikacji płci i przynależności gatunkowej osobnika. W tym przypadku wykorzystuje się allele specyficzne dla danego gatunku, a nawet rasy. Przykład identyfikacji gatunków za pomocą markerów mikrosatelitarnych przedstawiono w poniższej, Liczba par zasad w analizowanych loci jest charakterystyczna dla poszczególnych gatunków. Przeprowadzając analizę długości mikrosatelit dla konkretnego locus można wykluczyć (lub potwierdzić), że badana próbka DNA pochodzi od psa.

Wróć